RNA速率RNA velocity是单细胞转录组研究中非常经典的分析手段通过统计细胞内剪接与未剪接mRNA的比例推断细胞分化方向、细胞状态转变轨迹挖掘细胞拟时间动态演化过程。传统本地执行RNA‑velocity分析需要处理BAM文件、生成loom文件、完成数据整合与可视化代码链路长对使用者R语言编程能力有一定门槛。本文介绍HiOmics RNA速率分步在线工具上传对应文件即可完成全套分析与绘图输出。整套工具拆分为Step1‑Step5共5个功能模块模块之间上下游输入输出严格衔接样本数为1个的时候可以跳过Step3样本合并步骤。Step1单细胞转录组RNA速率分析step1Seurat对象数据预处理工具地址https://www.henbio.com/tooldetail?id487本步骤主要用于数据准备输入文件为已经完成细胞类型注释的Seurat RDS文件。工具会自动提取barcode标签、细胞坐标、metadata、表达矩阵统一校正barcode标签保证和前面细胞分群、细胞类型注释上游分析的标签完全匹配。1. 上传经过细胞注释的Seuratproject rds文件运行2. 在项目结果下载coordinate_result tar压缩包。解压后得到文件夹coordinate_result内部包含barcodes、counts矩阵、基因列表、metadata、PCA、UMAP坐标等一系列中间表格文件作为Step4的输入数据目录。Step2单细胞转录组RNA速率分析step2BAM文件转换生成loom文件工具地址https://www.henbio.com/tooldetail?id488该步骤接收Cell Ranger输出的BAM文件完成bam文件处理输出每个样本对应的loom文件是RNA速率分析的核心上游步骤。1. 新建文件夹把样本对应的排序bam文件、barcodes.tsv文件放到同一个文件夹内作为BAM文件目录上传2. 选择对应的物种名称例如Homo sapiens和Mus musculus3. 提交运行下载结果压缩包解压得到单样本loom文件。每一个样本都需要单独跑一次step2每个样本各自生成一份loom文件。Step3单细胞转录组RNA速率分析step3多样本loom文件合并工具地址https://www.henbio.com/tooldetail?id494只有≥2个样本才需要运行本步骤单样本直接跳过使用step2输出loom进入step4。1. 将step2输出的全部样本loom文件统一放到同一个文件夹2. 将该文件夹作为loom文件目录上传3. 运行任务下载得到合并后的uterus loom文件用于下一步速率计算。Step4单细胞转录组RNA速率分析step4RNA速率计算与全局可视化工具地址https://www.henbio.com/tooldetail?id495Step4完成RNA velocity核心计算输出细胞分化矢量图、置信度、速率基因列表等全套图表结果。需要两类输入1.Step1解压完成的coordinate_result文件夹作为数据目录2.Step3输出合并后的uterus loom单样本直接填step2得到loom文件3. 填写样本名映射表格第一列填写loom文件名称第二列填写自定义样本名称样本名必须和上游Seurat对象metadata样本命名保持一致。提交运行后输出结果包含UMAP速率矢量图、细胞类型占比PDF、速率置信度PDF、高速率基因列表csv以及h5ad格式中间文件adata_ldata_last h5ad。该h5ad文件是Step5的输入文件。Step5单细胞转录组RNA速率分析step5目标基因速率可视化可选工具地址https://www.henbio.com/tooldetail?id496本步骤属于可选分析用于针对性查看自己关注的基因的RNA速率分布输出基因spliced‑unspliced散点图、基因表达空间分布图。1. 上传step4输出的adata_ldata_last h5ad2. 在基因表格填入需要关注的基因名例如KRT19、SOX9、EPCAM3. 设置分组列名一般填celltype按照细胞类型分组展示结果4. 运行后输出genes_expression_pdf得到各个目标基因的速率可视化结果可直接用于论文配图。实操关键注意事项1. 全流程所有上传文件、文件夹名称禁止中文、空格、特殊符号否则会直接报错2. 文件上下游强依赖Step1来自注释完毕的Seurat对象Step2来自CellRanger输出bam上下游barcode必须完全对齐3. 单样本直接跳过Step3不要强行运行合并模块4. 每一步任务结束后务必下载保存结果压缩包后续步骤需要使用解压之后的文件。总结这套分步式RNA速率在线工具把原本需要多步代码、多个软件协作的复杂流程网页化。研究者只需要准备好Cell Ranger输出结果与注释完成的Seurat对象按照step1‑step5顺序执行即可完成RNA速率计算、分化轨迹绘图、目标基因速率可视化降低了单细胞拟时序动态研究的分析门槛输出的图表和表格可以直接用于后续论文撰写。
