摘要本文基于IZON Science高级科学家发表在IZON官网的研究数据系统阐述Exoid和TRPS技术的四大核心优势为EV及纳米医学研究者提供技术选型参考。关键词外泌体、细胞外囊泡、Exoid、TRPS、Zeta电位、单颗粒表征、纳米颗粒、可调电阻脉冲传感、粒径分析、纳米药物在细胞外囊泡、脂质纳米颗粒及病毒载体等生物纳米颗粒研究领域颗粒的粒径、浓度和Zeta电位是决定其生物学功能与药物递送效率的关键质量属性。然而“用什么技术来测量”这一问题长期困扰着许多研究者。IZON Science自2008年起深耕纳米颗粒分析领域其核心产品Exoid搭载的可调电阻脉冲传感Tunable Resistive Pulse SensingTRPS技术凭借单颗粒级别的物理测量原理可直接测得颗粒真实粒径、浓度与Zeta电位突破光学类检测手段的固有局限为细胞外囊泡等生物纳米颗粒提供高分辨率、可溯源的单颗粒表征方案。相关产品与技术资料可参考iZON Exoid与纳米颗粒分析资料。以下结合IZON官网发表的研究数据整理选择Exoid的四大理由。一、TRPS技术原理速览为什么它能做到“逐个测量”在介绍四大理由之前先简单介绍Exoid的核心技术TRPS也就是Tunable Resistive Pulse Sensing可调电阻脉冲传感。图1. TRPS工作原理示意图TRPS的测量原理基于物理阻抗变化而非光学信号。首先将待测纳米颗粒悬浮于PBS等电解质溶液中随后颗粒在外加压力驱动下逐个通过可调节孔径的纳米孔当颗粒穿过纳米孔时会取代部分电解液导致孔内离子电流出现瞬间阻断Blockade设备进一步对这些阻断信号进行解码其中阻断信号幅度与颗粒体积成正比可得出粒径阻断信号频率可得出颗粒浓度阻断信号持续时间反映颗粒运动速度可得出颗粒Zeta电位。每次测量均使用与美国国家标准与技术研究院NIST追溯的标准校准颗粒进行比对以确保数据可重复、可比。图2. Exoid单颗粒表征系统TRPS不依赖颗粒或分散剂的光学性质先验知识。这意味着颗粒折射率未知或溶液略有颜色时TRPS仍可从电学阻断信号角度进行测量这也是其与光学检测技术形成互补的重要原因。二、选择Exoid的四大理由详解理由1准确性高——Exoid“看得清”准确性是纳米颗粒表征的重要准则。原文中使用一组四模态标准品也就是含四种粒径颗粒的混合物对TRPS、NTA和MADLS多角度动态光散射进行了比较。图3. TRPS、NTA与MADLS在四模态样品中的颗粒分辨能力。图片改编自Vogel等人的相关研究数据。TRPS可清晰呈现四个颗粒群并实现基线分离能够准确识别每一个亚群NTA漏掉了一个颗粒群并将其他颗粒群混在一起分辨率不足MADLS只能模糊感知到四个颗粒群中间可能存在一些信号但无法分辨独立亚群。这个结果提示在纳米药物开发中聚集体可能导致免疫原性反应在EV标志物研究中漏掉亚群可能意味着丢失关键生物学信息。因此Exoid的准确性并不是锦上添花而是复杂纳米颗粒表征中的关键能力。理由2逐颗粒测量——从“群体平均”到“单颗粒表征”Exoid仅需35 μL样品体积即可实现逐颗粒particle-by-particle的粒径和Zeta电位分析。更重要的是系统可以导出每一个颗粒的原始数据便于进行统计学比较。图4. Exoid单颗粒分析能力图4中A展示三模态样品中通过尺寸和浓度测量清晰显示三个独立颗粒群B展示通过尺寸和Zeta电位测量显示三模态样品中的不同亚群C展示B中不同亚群的原始逐颗粒Zeta电位数据D展示颗粒装载核酸后粒径变化E展示颗粒装载DNA后Zeta电位变化。逐颗粒分析能力在多种研究中已经展现出价值例如纳米载药监控可通过追踪每个颗粒装载药物前后的尺寸和浓度变化评估装载效率异质亚群区分可在多分散EV样本中通过尺寸与Zeta电位双参数散点图无标记可视化不同亚群统计分析则可在导出单颗粒数据后对整个样本或样本内不同亚群进行比较。理由3实时动态分析——见证颗粒的“此时此刻”Exoid样品在测量过程中是开放可及的。Exoid的设计将待测样品置于上流体池中一旦打开设备盖子样品即可自由接触。这意味着研究者可以直接在测量孔中向样品添加试剂并实时追踪颗粒变化。图5. Exoid实时动态分析图5中A展示添加表面修饰剂或装载货物时测量颗粒实时变化的两个简单步骤B展示按步骤A添加DNA后颗粒Zeta电位的实时下降数据。该能力的实际应用价值较高例如可用于纳米装载过程监控。利用此功能实时监控DNA装载到磁性纳米颗粒上的过程时可以观察到颗粒Zeta电位随DNA装载而持续下降从而计算装载效率和时间窗口。理由4可调性——灵活适配从EV到微生物的全尺度测量TRPS中的“T”代表Tunable也就是可调。这是Exoid区别于固定孔径设备的核心设计理念。可调性主要体现在两个层面一是多纳米孔尺寸可选二是选定纳米孔后仍可通过拉伸调节进一步优化测量条件。纳米孔型号典型测量范围适用样品示例NP10050–330 nm外泌体、小型EV、AAV病毒载体NP20085–500 nm中型EV、慢病毒、小型LNPNP300130–900 nm大型EV、微囊泡、中型LNPNP1000490–2900 nm细胞、微米级颗粒NP40001990–11300 nm游动孢子、微生物、大细胞表1. Exoid纳米孔检测范围和适配样本选定一种纳米孔后还可通过Exoid自动化系统将纳米孔拉伸到不同孔径宽度无需更换纳米孔即可优化不同尺寸颗粒的测量条件。这意味着一种纳米孔可以覆盖跨越数倍的尺寸范围提升操作灵活性和效率。图6. Exoid可调性的应用图6中A展示使用TRPS测量携带SARS-CoV-2 siRNA的小型脂质纳米颗粒B展示使用TRPS测量大型游动孢子。这也说明TRPS的应用对象并不局限于外泌体还可覆盖更宽范围的纳米颗粒和微米级颗粒样本。三、Exoid应用场景Exoid的宽量程和高分辨率使其可以应用在多个前沿领域。在细胞外囊泡和外泌体研究中Exoid可用于获取EV真实浓度与尺寸分布为标志物发现和液体活检提供数据基础也可用于监测疾病进展或储存条件对EV Zeta电位的影响还可高分辨率识别EV异质亚群例如外泌体、微囊泡和脂蛋白颗粒且无需荧光标记与qEV纯化柱联用时也可形成“分离—表征”的标准化闭环满足EV研究中对正交验证的需求。在脂质纳米颗粒和脂质体研究中Exoid可用于高分辨率捕捉LNP装载mRNA或siRNA前后的微小尺寸变化也可评估LNP制剂的聚集行为和冻融稳定性。由于Exoid可检测到大聚集体因此适合用于纳米制剂稳定性和处方筛选。在病毒与病毒样颗粒研究中Exoid可用于定量测量总病毒颗粒浓度为基因治疗和疫苗开发中的病毒载体提供质量控制数据同时也可检测缺陷干扰颗粒Defective Interfering ParticlesDIPs等影响病毒载体质量但容易被忽视的颗粒亚群。在纳米药物递送系统中Exoid可为纳米级药物产品提供粒径、浓度和Zeta电位三合一测量方案并可实时监控药物装载效率从而缩短处方筛选周期。关于IZON ScienceIZON Science成立于2008年总部位于新西兰是纳米颗粒分离与分析解决方案相关企业同时布局外泌体纯化和外泌体单颗粒表征等技术方向并通过ISO 13485认证。其产品体系覆盖qEV系列外泌体纯化柱、自动化纯化系统以及Exoid/Pulsoid等纳米颗粒分析设备。对于外泌体与纳米颗粒研究团队而言IZON体系的价值不仅在于单一设备也在于可从样本分离、纯化到单颗粒表征建立连续技术路径。参考文献Akers JC, et al. Comparative Analysis of Technologies for Quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF).PLoS ONE. 2016.Vestad B, et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.Journal of Extracellular Vesicles. 2017;6:1344087.Bachurski D, et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis: An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.Journal of Extracellular Vesicles. 2019;8:1596016.Vogel R, et al. Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge?Journal of Extracellular Vesicles. 2021;10.Kuhnemund M, Nilsson M. Digital quantification of rolling circle amplified single DNA molecules in a resistive pulse sensing nanopore.Biosensors and Bioelectronics. 2015;67:11-17.Vogel R, et al. High-Resolution Single Particle Zeta Potential Characterisation of Biological Nanoparticles using Tunable Resistive Pulse Sensing.Scientific Reports. 2017;7.Idris A, et al. 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