一、提出核心技术问题在核酸适配体筛选的全流程中核酸适配体文库测序是最关键的终点环节其质量直接决定了能否获得高亲和力、高特异性的候选适配体。然而经典的Sanger测序法由于通量低、效率差长期制约了优质适配体的发现效率。2023年贾海静等在《生物化学与生物物理进展》发表特邀综述系统梳理了这一问题的技术根源以及解决方案。本文基于该综述并结合相关文献从技术实现角度对其进行拆解。二、分析问题传统测序方案的技术缺陷从SELEX的技术流程来看测序位于最后一个环节文库设计→靶标孵育→分离→PCR扩增→核酸适配体文库测序→候选筛选→亲和力评价。传统技术方案存在以下根本性缺陷缺陷1通量严重不足典型的SELEX起始文库包含10¹⁴-10¹⁵个随机序列。经过多轮筛选后富集文库中仍然可能存在成千上万种不同的序列。传统方案中将PCR产物与载体连接、转化宿主细胞、挑取少量克隆子通常20-100个进行Sanger测序只能覆盖文库的极小部分。缺陷2遗漏稀有序列高亲和力的适配体未必是文库中丰度最高的序列。在传统的少样本测序策略中那些稀有但实际结合能力更强的候选序列极容易被遗漏。缺陷3PCR偏向性积累多轮筛选循环中PCR扩增的偏向性会导致某些序列被选择性放大或丢失。NGS可以监控这种偏向性而传统测序无法做到。三、解决问题高通量测序的引入与技术方案综述明确指出随着二代测序价格的下降高通量SELEX的二代测序技术已是核酸适配体筛选进程研究和候选适配体筛选的常规技术步骤。1技术框架在SELEX流程中整合NGS涉及的关键步骤包括文库制备将单链DNA/RNA转化为双链DNA添加测序接头边合成边测序以Illumina平台为代表的方案同时对数百万条模板进行测序数据分析包括预处理、富集分析、序列聚类和结合位点搜索2生物信息学分析策略综述及相关研究总结了多款HT-SELEX数据分析工具FASTAptamer基于序列丰度分析的经典工具APTANI侧重结构特征分析AptaTRACE全序列聚类高准确性FSBC (Fast String-Based Clustering)通过搜索各种长度的过表达字符串来估计聚类可处理超过1500万条序列聚类准确性和计算速度表现优异3小分子靶标的特殊考量综述特别针对小分子靶标适配体筛选进行了深入评述。由于小分子结合位点少、结构类似物多筛选难度更大。为此研究了三类主要方法基于靶标固定存在空间位阻问题但操作简单应用广泛Capture-SELEX文库固定‍统计了36种靶标的数据降低靶标浓度有利于提高亲和力GO-SELEX均相筛选‍筛选轮数更少获得的适配体亲和力多在nmol/L水平四、解决方案的效果数据汇总综述及相关研究的量化数据序列通量提升从传统方法的20-100条 → NGS方法10 000条筛选轮数缩短Capture-SELEX一般7-15轮GO-SELEX可达5-8轮部分快速筛选方法可在5轮内完成亲和力水平小分子靶标适配体的Kd值已达纳摩尔级10⁻⁹ mol/L例如噻虫嗪适配体Kd123 nmol/L黄曲霉毒素M1适配体Kd109 nmol/L特异性评价多种表征技术SPR、ITC、BLI、纳米金比色法的组合应用可实现多角度验证结语NGS技术与SELEX的结合使核酸适配体文库测序从抽样式升级为全谱式这一基础性技术变革正在推动适配体筛选的效率大幅提升。然而缺乏标准化的筛选程序、缺乏统一的大数据分析法则仍是未来的突破方向。参考文献[1] 贾海静, 高亚菁, 娄新徽. 核酸适配体筛选与亲和力评价技术主要研究方向、进展与挑战[J]. 生物化学与生物物理进展, 2023, 50(09): 2051-2076.[2] Aoki T. Fast string-based clustering (FSBC) for high-throughput SELEX data[J]. Methods, 2019.[3] 王钰. 甲氧苄啶适配体的筛选与应用鉴定[D]. 南京农业大学, 2023.