一、背景与问题在蛋白质相互作用研究中传统的线性多肽面临两大核心困境其一线性肽在生理环境中容易被蛋白酶快速降解代谢半衰期极短其二线性肽缺乏固定的三维构象难以实现高选择性和高亲和力的结合。多环肽则通过引入两个或以上的环状结构单元在分子尺度上实现对肽链构象的精准约束。正如Chen等人在2024年《ChemBioChem》综述中所总结的多环肽能够提供更高的构象刚性和代谢稳定性并且在抑制蛋白质-蛋白质相互作用方面展现出显著增强的效力。二、构建方案详解方案1二硫键定向成环原理利用肽链中半胱氨酸残基之间的氧化交联形成分子内二硫键将线性肽约束为环状构象。技术细节在噬菌体多肽库中设计包含多个Cys的随机肽序列利用氧化条件如空气氧化或谷胱甘肽氧化还原系统促进二硫键形成厦门大学团队开发的二硫键导向基序DDMP策略通过调控Cys的配对模式实现定向折叠性能数据实现了对EphA2蛋白靶标的纳摩尔级亲和力筛选库容量虽受限于约10⁶但序列空间覆盖效率高方案2化学交联剂环化原理使用多官能团化学交联剂同时与肽链中多个半胱氨酸发生反应一步实现多环化。关键技术参数参数说明交联剂类型TBAB三(溴甲基)苯、TATA、TAAB等肽模式C-(X)₆-C-(X)₆-C三个Cys间隔6个随机氨基酸库容量可达10¹¹1000亿级别骨架多样性可覆盖273种不同骨架结构筛选案例针对FXIa蛋白酶催化域筛选成功获得低纳摩尔级抑制剂针对4种不同蛋白靶标人丝氨酸蛋白酶、炎症标志物、受体蛋白均筛到纳摩尔结合物方案3金属离子介导环化原理利用亲硫金属离子Bi³⁺、As³⁺等与Cys巯基的配位作用形成以金属离子为核心的多环肽构象。关键实验步骤在M13噬菌体上展示含3个Cys的随机线性肽库用Bi³⁺处理使肽链环化对固定化靶蛋白进行亲和淘选NGS测序分析富集序列合成候选肽进行亲和力验证数据对比Bi³⁺环化前线性肽Kd 39 ± 6 μMBi³⁺环化后双环肽Kd 0.31 ± 0.04 μM亲和力提升-126倍方案4酶催化环化原理利用分选酶ASortase A, SrtA介导的肽连接和环化反应在噬菌体表面直接实现环化。关键技术指标对TEAD4靶标的筛选获得双环肽Kd 63.9 nM环化后亲和力比非环化肽提高102倍三、方案选择决策树需要多环肽配体 ├─ 靶蛋白三维结构已知 → 优先考虑DDMP定向二硫键策略可精准设计 ├─ 需要超高库容量 → 选择TBAB化学交联策略库容可达10¹¹ ├─ 追求操作简便 → Bi³⁺金属介导一步环化、条件温和 └─ 需要酶相容性修饰 → SrtA酶催化策略四、总结噬菌体多肽库构建多环肽的核心技术已经形成完整的工具箱。选择哪种环化策略需要综合考虑靶蛋白特性、所需库容量、操作便捷性和最终亲和力指标。对于国内生物技术公司的研发团队而言理解各种环化技术的优势和局限有助于在项目中做出最优技术决策。参考文献[1] Chen F-J et al.,ChemBioChem, 2024, e202400072[2] Duan Z et al.,Nat Commun, 2024, 15: 51723[3] He R-N et al.,JACS Lett, 2024[4] Zhang Y-N et al.,ChemRxiv, 2024[5] Carle V et al.,PEDS, 2021