简言之解析蛋白在细胞内的空间排布需要联合成像与互作数据但规模化获取类数据技术门槛极高。本文建立HIT-MAP标准化分析流程利用同一基因编辑细胞系同步获取免疫荧光、互作质谱类多组数据大幅降低亚细胞图谱构建门槛。tidekerhealth.ucsd.educhavez2health.ucsd.edu#免疫荧光 #亲和纯化质谱 #多模态整合 #亚细胞定位 #蛋白互作网络 #剪接体 #CRISPR敲入 #宽场显微镜 #反卷积成像 #内源蛋白标记亮点HIT-MAP将内源蛋白标签、免疫荧光成像、亲和纯化质谱AP-MS技术一体化整合9×FLAG标签相比3×FLAG对内源表达蛋白的检测灵敏度显著提升反卷积宽场显微镜成像可得到接近共聚焦的蛋白定位图像多模态数据联合分析筛选出CCDC12作为剪接体Bact复合物新组分摘要免疫荧光成像、AP-MS是解析亚细胞蛋白排布核心手段但现有方案成本高、难以规模化且大多只能单独采集成像或互作数据无法统一分析。本文开发高通量整合细胞图谱标签流程HIT-MAP基于CRISPR内源表位标记技术搭配标准化宽场荧光成像与优化互作质谱方案可在同一克隆细胞系同步采集类模态数据。以HEK293T细胞16种代表性蛋白为模型完成验证HIT-MAP共鉴定出576组高置信蛋白互作复现经典蛋白复合物并区分多模态联合聚类的蛋白亚群。多组学整合分析证实CCDC12是未被充分研究的人源剪接体Bact复合物组分该结论得到亲和纯化质谱、无标签尺寸排阻色谱质谱、扰动转录组重证据支撑。HIT-MAP大幅降低多模态亚细胞图谱的技术与经济门槛。结果HIT-MAP整体流程与表位标签筛选基准图1 HIT-MAP多组学数据采集完整流程示意(a) 3步核心流程步骤1基于CRISPR高通量内源FLAG敲入构建稳定FLAG标记细胞系步骤2同一标记细胞系同步开展免疫荧光成像、FLAG亲和纯化质谱免疫荧光捕捉蛋白亚细胞定位AP-MS捕捉蛋白生物互作步骤3多模态数据整合构建全局蛋白图谱挖掘未知功能蛋白复合物。(b) 分步实验管线内源FLAG克隆细胞系分为2条平行实验分支荧光分支经Z轴堆叠成像、理查森-露西反卷积去除失焦杂光得到等效共聚焦定位图质谱分支采用抗FLAG磁珠富集互作蛋白打分构建高置信互作网络。反卷积宽场成像可等效共聚焦定位精度图2 免疫荧光成像体系基准验证(A) 宽场图像处理流程采集31层Z堆叠原始图像经点扩散函数反卷积、深度学习嵌入得到1024维蛋白定位特征向量(B) 3×FLAG、9×FLAG标记蛋白成像特征与人类蛋白图谱HPA参考图相似度对比配对t检验p0.09(C) 原始宽场图像、反卷积宽场图像分别与HPA图谱相似度小提琴图p0.0007(D) 16种靶蛋白9×FLAG反卷积荧光代表图黄色 核蛋白、红色 线粒体蛋白、蓝色 胞质蛋白(E) 全部蛋白荧光特征分层聚类热图顶部色条标注HPA亚细胞分区(F) 同一亚细胞/跨亚细胞蛋白特征余弦相似度小提琴图曼-惠特尼U检验p9.8×10⁻¹⁷。内源AP-MS捕获高置信蛋白互作网络图3 HIT-MAP稳定捕获内源蛋白互作网络(A) AP-MS数据处理管线DDA质谱采集→互作打分筛选高置信蛋白互作→Node2Vec网络嵌入(B) 3×FLAG、9×FLAG数据分别基于CORUM、STRING、hu.MAP数据库的ROC曲线AUROC对比(C) 各诱饵蛋白鉴定已知/新互作数量柱状图粉色 数据库已有互作、灰色 全新互作(D) 本研究与传统AP-MS方案对CORUM复合物富集比值箱线图无统计学差异(E) 9×FLAG数据集全局蛋白互作网络色块标注CORUM经典复合物剪接体、核糖体、SMN复合物、NuA4乙酰转移酶复合物等。多模态联合聚类挖掘蛋白功能社群图4 成像质谱双模态整合嵌入与功能验证(A) 多模态整合UMAP降维图聚类分为核糖体、剪接体E/C复合物、染色质调控、线粒体5大蛋白集群(B) 3类特征荧光嵌入、互作网络嵌入、联合多模态嵌入两两相关性热图(C) 3类模态下高相似蛋白对的STRING通路距离分布密度图(D) CCDC12蛋白尺寸排阻色谱共洗脱热图显示其与剪接体Bact组分共流出(E) CCDC12敲低转录扰动特征与各类剪接体复合物相似度小提琴图全部分组对比p均 0.01。讨论HIT-MAP相较传统方案核心优势图5 传统方案与HIT-MAP资源、成本对比(A/B) 传统成像/质谱流程vs HIT-MAP资源需求对比传统需单一样本处理、蛋白特异性抗体、高端设备HIT-MAP批量操作、通用抗体、常规显微镜传统依赖cDNA过表达HIT-MAP维持内源生理表达(C/D) 不同靶标数量下2类方案成像、质谱总成本柱状图灰色 传统方法绿色 HIT-MAP。数据和代码本研究质谱蛋白质组原始数据已存入ProteomeXchange联盟旗下PRIDE数据库数据集编号PXD06789516种试点蛋白对应的3×FLAG、9×FLAG标记细胞系共聚焦图像、原始宽场图像、反卷积处理后图像全部上传至BioImage Archive归档编号S-BIAD2261论文全部原始代码归档于Zenodo平台https://doi.org/10.5281/zenodo.20548576开发版本持续维护于GitHub仓库https://github.com/idekerlab/hit_map详细总结思维导图研究背景与现有技术痛点IF成像相似度和HPA人类蛋白图谱参考比对宽场成像反卷积效果验证HIT-MAP成本与规模化优势对比参考Cell Rep Methods. 2026 Jul 22:101534. doi: 10.1016/j.crmeth.2026.101534.HIT-MAP: A scalable approach to multimodal mapping of subcellular organization注AI辅助创作如有不当欢迎指出。内容仅供参考不构成任何建议。