摘要开发基于Physio Mimix的黑色素瘤器官芯片重建血管内皮屏障及肿瘤微环境评估抗HLA-GCAR-T细胞的迁移、跨内皮浸润及杀伤活性为免疫治疗研究提供新型体外模型。关键词器官芯片、Organ-on-Chip、CAR-T细胞、CAR-T疗法、免疫细胞迁移、黑色素瘤、血管内皮屏障、肿瘤微环境、免疫治疗、体外药效评估、抗HLA-G、PhysioMimix本文为2026年6月22日至24日CNBio在葡萄牙布拉加的EUROoCS Annual Meeting欧洲器官芯片年会上展示的海报该项目由欧盟资助同时英国和瑞士合作单位分别由本国科研资助机构提供经费支持。需要原文的可联系曼博生物获取。图EUROoCS Annual Meeting20262026欧洲器官芯片年会一、用于评估CAR-T细胞疗法疗效与毒性的3D灌流黑色素瘤芯片模型癌症芯片Cancer-on-a-chip等临床前模型正处于癌症研究的前沿然而能够完整模拟CAR-T细胞等免疫治疗全过程免疫级联反应的模型仍然十分有限。这些过程包括血液循环、跨内皮迁移、肿瘤浸润以及癌细胞裂解。利用更相关的体外系统重建肿瘤微环境所形成的物理和生化屏障对于研究CAR-T细胞针对原发肿瘤的作用表现很重要同时还能为其潜在不良反应提供深入认识。作为Melomanes项目利用磁性纳米颗粒治疗转移性黑色素瘤的联合疗法的一部分——这是一个覆盖整个欧盟的研究联盟致力于开发一种结合抗HLA-GCAR-T细胞和能够诱导局部高温的磁性纳米颗粒的免疫治疗策略——本项目旨在开发一种更相关的黑色素瘤芯片模型用于评估CAR-T细胞治疗的疗效与安全性。该模型基于PhysioMimix CoreCNBio Innovations构建通过培养基循环模拟血液流动。基于Transwell的双腔室策略能够实现趋化因子调控的人脐静脉内皮细胞HUVEC单层上的免疫细胞迁移。这类基于人体来源细胞的临床前模型有望提高预测准确性同时减少对体内动物实验的依赖。二、研究目标是什么•利用人黑色素瘤细胞系SK-MEL-5构建黑色素瘤芯片模型。•构建由HUVEC组成的人源内皮屏障并研究TNF-α刺激引起的内皮活化。•评估基底侧灌流basolateral perfusion对内皮屏障形成的影响。•评价趋化因子介导的CAR-T细胞运动能力及其跨越内皮层迁移能力并分析其与内皮活化状态之间的关系。•研究不同灌流条件及内皮活化状态下CAR-T细胞的细胞毒性作用。三、研究方法1.黑色素瘤芯片模型的建立·利用PhysioMimix系统建立效应细胞/内皮细胞器官芯片系统。·将HUVEC接种于IV型胶原Collagentype IV包被的Transwell上并在0.5μL/s的培养基灌流速率下培养48h。·通过免疫荧光染色F-actin、ZO-1、跨内皮电阻TEER以及采用4kDaFITC-dextran的细胞旁通透性检测对屏障形成情况进行评价。·采用慢病毒lentivirus转导使SK-MEL-5稳定表达HLA-G以确保其细胞表面持续表达。图1. 黑色素瘤芯片模型的建立2.模型生成的时间进程如下图图2. 黑色素瘤芯片模型生成的时间进程四、结果1.经TNF-α处理后可诱导VCAM-1表达上调并导致细胞黏附丧失、细胞形态发生改变以及内皮层通透性增加图3。图3.**Transwell膜基底侧内皮屏障的优化。**a左图为相差显微图像右图为相差显微图像与Phalloidin-FITC荧光图像的叠加图显示Transwell膜孔已被HUVEC覆盖。bTNF-α处理后Transwell上内皮细胞间黏附丧失Phalloidin绿色1:400ZO-1红色1:1000。cTNF-α刺激后免疫荧光IF染色显示VCAM-1表达上调左图1:500同时细胞形态表现为细胞体分离并呈细长状右图96孔板。2.通透性检测和TEER检测结果表明在灌流培养48h后内皮屏障完整性达到高水平图4。**图4.通过FITC-dextran测定表观渗透系数Papp并监测跨内皮电阻TEER评价内皮屏障完整性。**a.人Ⅳ型胶原包被Transwell膜可提高内皮屏障完整性。b.基底侧灌流和细胞接种方向均会影响内皮屏障完整性。c.HUVEC内皮屏障完整性具有时间依赖性随接种后的培养时间而发生动态变化。3.CAR-T细胞能够跨越Transwell膜发生迁移其迁移能力受内皮活化状态、趋化因子浓度以及培养基灌流条件的影响图5。**图5.免疫细胞跨越Transwell膜的迁移受内皮屏障表型和趋化因子信号传导的影响。**a.灌流和HUVEC的培养均会影响免疫细胞的迁移率及其滞留程度。b.细胞因子刺激、灌流以及缺乏趋化因子信号均导致免疫细胞的基础回收率更低。4.CAR-T细胞诱导的肿瘤细胞死亡效应细胞与靶细胞比例Effector-to-TargetratioE:T及培养基灌流条件调控。CAR-T细胞在完成跨内皮迁移后仍保持细胞毒性但其杀伤效率低于直接接触靶细胞时的水平图6。**图6.抗HLA-GCAR-T细胞对SK-MEL-5细胞的杀伤效率受基底侧灌流和内皮屏障限制的效应细胞相互作用调控。**a.癌细胞死亡速率取决于效应细胞与靶细胞比例E:T。b.在24h时灌流培养可使较低E:T比例下仍产生细胞毒作用。c.跨越血管内皮屏障的迁移会影响癌细胞死亡速率其作用取决于细胞因子处理。五、结论1.本研究构建了一款黑色素瘤芯片模型体系共包含原代抗人类白细胞抗原GHLA-GCAR-T细胞、内皮细胞系与肿瘤细胞系可在动态流体体系中复现CAR-T细胞免疫级联反应的核心过程。2.血管通透性实验证实优化胞外基质ECM包被方案并配合灌流培养能够明显提升人脐静脉内皮细胞HUVEC屏障结构的完整性。3.基于荧光素酶的细胞毒性检测结果显示CAR-T细胞可介导明显的肿瘤细胞裂解效应该杀伤效果取决于效靶比E:T、基底侧灌流条件以及靶细胞抗原表达水平。4.分别经肿瘤坏死因子αTNF-α处理、未处理的人脐静脉内皮细胞接种于Transwell小室后会形成屏障阻隔层相较于无屏障共培养体系该结构会大幅降低SK-MEL-5黑色素瘤靶细胞的裂解效率。5.该器官芯片系统可作为贴合生理真实环境的临床前研究工具用于实体瘤中CAR-T细胞的迁移浸润与药效评估有望应用于细胞治疗方案优化及安全性评价工作。扩展阅读1.LifeNet Health人类肝脏原代细胞与培养体系让每一次研究都贴近生理真相2.CNBio微流控器官芯片系统在多种MPS中领跑胆汁淤积性DILI预测本文基于CNBio公开资料由其中国提供商曼博生物整理用于科研信息分享、实验参考等。曼博生物可提供CNBio PhysioMimix器官芯片系统、PhysioMimix Core、肿瘤器官芯片、3D灌流黑色素瘤模型、CAR-T细胞迁移与浸润评估、血管内皮屏障模型、肿瘤微环境重建及体外药效评价相关产品与技术支持支持免疫治疗研究、CAR-T细胞疗法评估、实体瘤药效分析、细胞治疗方案优化及临床前安全性评价应用。