如上图所示WB (Western Blot) 实验出现非特异条带或多带这通常与蛋白样本本身的生物学特性、样本制备时的降解/修饰、以及抗体与实验操作有关。具体原因和排查方向如下反思 1是不是目的蛋白本身存在多种剪接体导致分子量大小不同【建议】查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码 mRNA。反思 2蛋白本身具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等【建议】查阅文献或者通过 UniProt 数据库查询目的蛋白的修饰位点信息确定目的蛋白是否存在多种修饰如泛素化、糖基化等修饰会让蛋白的条带发生较大的偏移。常见修饰的 WB 表现磷酸化 (Phosphorylation) 会使分子量增加 (每个磷酸基团约增加 (80 Da)) 常导致出现紧密相邻的双条带或多条带 (如 AKT1) 。糖基化 (Glycosylation) 可添加几千甚至上万道尔顿的糖链导致条带显著变大、变宽或呈现弥散状。泛素化 (Ubiquitination)、乙酰化 (Acetylation) 等 会引起条带的微小上移或条带分层。反思 3有没有可能目的蛋白本身存在二聚体或多聚体多聚体导致的条带呈现出特定的规律 (如分子量分别为单体的 2 倍、3 倍)且会随目的蛋白表达量的增加而等比例加深。【建议】可增加上样缓冲液 (Loading Buffer) 中 DTT 或 β-巯基乙醇的浓度或将样品在下的加热时间延长至 95~100℃ 煮沸 5-10 分钟观察高分子量条带是否减弱或消失。反思 4是不是样品处理不当【建议】① SDS loading buffer 中现用现加 β巯基乙醇或 DTT。这两种还原剂在溶液中极不稳定还原剂极易被氧化或挥发久置会造成浓度大幅下降。若提前加入并长期保存会导致还原剂失效失效的还原剂无法提供足量的巯基 (-SH) 会导致蛋白解聚不完全蛋白质无法完全变性产生异常条带或多聚体。② 煮样时煮沸约 10 分钟使蛋白质解聚。膜蛋白若过度煮沸易聚集形成大分子复合物未煮沸或还原剂失效蛋白未充分变性也会导致异常条带。反思 5有没有可能蛋白质在提取或样本保存过程中发生了降解当蛋白质在提取或样本保存过程中发生降解时完整的蛋白分子会被蛋白酶切断。如果降解发生在抗体结合域或者不同分子被切割的位置不同就会产生分子量比原目的蛋白小的一系列截短片段。此时WB 条带中不仅会有原本的主带还会出现多条低分子量的杂带或条带模糊、向下拖尾的现象。Tips如果使用纯化的重组蛋白作为阳性对照只有单条带而你的实验样本出现多条带则降解可能性极大。【建议】①添加抑制剂裂解液确保含有蛋白酶抑制剂并超声抑制内源性蛋白酶的活性。②低温操作样本收集、处理和裂解的全过程必须在冰上进行并使用预冷的耗材和试剂。③避免反复冻融蛋白样品提取后80℃ 短期保存避免反复冻融有条件尽量用新鲜提取的蛋白。④及时煮沸变性提取完蛋白后尽快加入 Loading Buffer 并在 95~100℃ 煮沸 5-10 分钟以彻底失活蛋白酶。反思 6样本有没有“被污染”存在外源转入蛋白【建议】检查所用样本是否有过被外源进去带有标签的靶标蛋白。如有更换细胞系样本。反思 7是不是上样量“太多了”上样量过多会饱和抗体导致背景脏乱、条带扭曲粘连并增加抗体与非靶标蛋白的结合机会引发非特异性条带或多带现象。【建议】根据靶标表达情况进行梯度上样测试针对高表达目的蛋白单孔总蛋白量控制在 10-30 µg。首次实验可设置浓度梯度 (如 5、10、20、40 µg)以确定信噪比最佳的上样量。根据跑胶测试结果选择合适的上样量通常 20-30 µg即可。反思 8是不是抗体浓度“过高了”一抗或二抗浓度过大是产生非特异性条带的常见原因。【建议】一抗浓度过高常出现多条蛋白带可降低抗体浓度和/或瞬育时间。二抗浓度过高易产生非特异性结合可适当降低抗体浓度增加二抗对照 (不加一抗) 。反思 9有没有可能细胞系传代次数过多蛋白表达谱发生了变化【建议】使用未传代或传代次数较少的细胞系 (不超过 15 代) 进行样品制备。或者使用未传代或传代次数少的的细胞株和现在的细胞株一起做平行对照实验。反思 10检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白【建议】查阅文献报道或 BLAST 搜寻使用说明书推荐的细胞株或组织。若确保操作没问题那么您可能是发现了新蛋白