研究背景随着人口老龄化的进程加快越来越多的老年人被骨关节炎的疼痛困扰而基于干细胞的骨关节炎和软骨缺损疗法展现出优秀的临床转化前景。其中脂肪来源的干细胞ADSCs来源丰富、获取便捷、低创伤正成为组织工程与细胞治疗中优质的“种子细胞”。今天就让我们一同走进实验室盘点小鼠脂肪来源干细胞的分离培养与成软骨分化实验。一、小鼠原代ADSC分离培养小鼠ADSC细胞从腹股沟脂肪组织中分离。在小鼠安乐死后用75%乙醇浸泡消毒重复三次后在超净台中解剖获取腹股沟脂肪组织。将其在PBS缓冲液中多次洗涤后使用眼科剪剪碎1-3mm3的小颗粒。在DMEM培养基中添加2 mg/ml Collagenase A、2%胎牛血清和1%青链霉素双抗配制成消化液使用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌将上述脂肪组织颗粒转移入消化液中置于37℃摇床上振荡消化15分钟。消化完成后使用40μm孔径的尼龙筛网过滤消化液弃去未消化的组织颗粒。滤液离心后的沉淀即为原代细胞。使用含20%胎牛血清的DMEM培养基重悬沉淀计数后每个T75培养瓶中接种50万细胞置于5% CO2培养箱中进行培养。每3天更换一次培养基待达到80%融合度时使用含EDTA的胰酶进行消化传代。培养过程中培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子bFGF货号50037-M07E可促进MSC生长。Note所使用的义翘产品· 产品名称碱性成纤维细胞生长因子bFGF· 产品货号50037-M07E图1. 显微镜下P0代(A) 和P1代(B) ADSC的典型形态二、诱导ADSC成软骨分化成软骨诱导实验首先需要形成细胞凝聚体3D MSC pellet。细胞胰酶消化后以300 g离心力离心5分钟弃去上清后使用前述完全培养基重悬细胞计数、稀释至每毫升20万的细胞密度。15mL离心管中加入1mL细胞悬液以450 g离心力离心10分钟小心转移至培养箱后稍悬松离心管口促进气体交换注意不要晃动沉淀。过夜静置培养16小时以上形成细胞凝聚体。图2. 培养箱中使用15mL培养管培养细胞凝聚体的实拍图配制成软骨分化的诱导培养基向DMEM培养基中添加1X ITS添加剂、0.1 mM地塞米松、2 mM谷氨酰胺、10 ng/mL TGF-beta 1货号80116-RNAH涡旋混匀。Note所使用的义翘产品· 产品名称TGF-beta 1· 产品货号80116-RNAH成软骨分化培养小心吸去培养管中的原有培养基更换为成软骨分化培养基重新置于培养箱中开始成软骨分化图3圆圈中。图3. 成软骨分化形成的细胞球实拍图三、成软骨分化表型检测在前述培养条件下间充质干细胞逐渐发生软骨分化。分化早期细胞聚集体中不含软骨特异性分子胶原种类以I型胶原蛋白为主。约5天后细胞外基质中可逐渐检测到II型胶原蛋白。约2-3周后整个细胞凝聚体中合成以II型胶原蛋白聚糖为代表的软骨特异性分子产生丰富的细胞外基质进行成软骨分化评估实验。制作切片并染色定性评估诱导三周后收取细胞凝聚体浸泡在中性多聚甲醛固定液中固定24小时。经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋等步骤制作5-7μm厚度的石蜡切片。切片依次经二甲苯和梯度乙醇浸泡后使用去离子水冲洗5分钟。充分水化后使用甲苯胺蓝染色液浸染1-2分钟去离子水冲洗、乙醇脱水、二甲苯透明后进行封片在显微镜下观察和拍摄。分化良好的软骨细胞外基质将被甲苯胺蓝染料染色为深蓝紫色。切片也可用于进行软骨特异性指标如COL2 1和ACAN的免疫组化及免疫荧光染色根据染色图像定性评估分化水平。使用分光光度计定量评估使用木瓜蛋白酶溶液将细胞凝聚体消化充分离心后取上清液。对于凝聚体中的细胞数量可以通过Hoechst 332580.7 μg/ml染料检测样品中的DNA含量来定量评估即使用DNA标准品与待测凝聚体消化液分别与染料混合在340 nm的激发波⻓和465 nm的发射波⻓下读取板通过标准曲线计算样本中的 含量。对于凝聚体中软骨细胞外基质可使用番红O染料测量样本中的蛋白聚糖含量用于定量比较细胞外基质的积累程度。使用qPCR定量评估除了评估上述的细胞外胶原基质我们在分化实验中也常常需要检测关注的信号通路等因子的表达情况这时则需要使用TRIzol裂解液消化提取每个细胞凝聚体中的总RNA使用qPCR的方法检测Sox9、Col2a1、Acan等软骨相关因子和研究所关注的信号通路相关指标的表达情况。实例分析脂肪来源间充质干细胞进一步研究结果脂肪来源间充质干细胞的培养及成软骨分化仅是实验的开始研究人员进一步将实验材料用于骨关节炎OA治疗方法的研究。研究结果发表于Journal of Extracellular Vesicles期刊。通过上述步骤我们成功地完成了从小鼠脂肪组织中分离原代ADSC、在体外进行扩增培养到诱导其向软骨细胞分化并最终通过甲苯胺蓝染色、II型胶原免疫荧光染色等技术验证分化成果的全过程。本实验中应用到义翘神州的重组bFGFCat:50037-M07E蛋白和TGF-b1Cat:80116-RNAH蛋白对于促进ADSC增殖和分化至关重要。希望优质的重组蛋白能够为大家的实验顺利开展保驾护航探索ADSC成软骨分化的神奇世界。实验方案来自产品使用征文大赛用户投稿仅供学习交流。【参考文献】1. Yuan C, et al. Adipose-derived stem cell-based optimization strategies for musculoskeletal regeneration: recent advances and perspectives. Stem Cell Res Ther. 2024. doi: 10.1186/s13287-024-03703-6.2. Câmara DAD, et al. Adipose Tissue-Derived Stem Cells: The Biologic Basis and Future Directions for Tissue Engineering. Materials (Basel). 2020. doi: 10.3390/ma13143210.3. Solchaga LA, Penick KJ, Welter JF. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 2011. doi: 10.1007/978-1-60761-999-4_204. Hsieh CC, et al. Protocol for efficient human MSC chondrogenesis via Wnt antagonism instead of TGF-β. STAR Protoc. 2023. doi: 10.1016/j.xpro.2023.102728I